Sorter-Anreicherung kleiner B-NHL-Klone für NGS-Analysen

Bei der Diagnose von B-Zelllymphomen spielt neben Histologie und Immunphänotypisierung die Molekulargenetik eine wichtige Rolle (WHO 2022). Mit Einführung moderner Hochdurchsatz-Sequenzierungsverfahren (Next Generation Sequencing, NGS) können heute parallel hunderttausende Genombereiche innerhalb kürzester Zeit analysiert werden. Das sog. Panel Testing erlaubt die Analyse mehrerer Lymphom-relevanter Gene (ca. 66) in einem Testdurchlauf in weniger als einer Woche und spielt somit eine wichtige Rolle bei:

• der Sicherung der Diagnose (z.B. MYD88, BRAF, NOTCH2, KLF6)

• der Beurteilung der Prognose (z.B. TP53, CXCR4)

von B-Zelllymphomen.

Niedrig infiltrierende bzw. ausschwemmende Lymphome (< 5% Klongröße) können derzeit jedoch aufgrund fehlender Sensitivität nicht per Panel-NGS molekulargenetisch untersucht werden. Für die Haarzellleukämie und das lymphoplasmozytische Lymphom wurden daher sensitive quantitative PCR-Analysen auf mRNA Ebene am MLL etabliert, die auch bei Klongrößen <5% den zuverlässigen Nachweis von Mutationen in BRAF und MYD88 erlauben. Bei anderen B-NHL-Entitäten kann unter folgenden Umständen jedoch eine diagnostische Herausforderung entstehen:

• bei Vorliegen klinischer Symptome und notwendiger Therapie

• kein eindeutiger Immunphänotyp (z.B. CD5-negative splenische B-NHL)

• histologisches Gewebe nicht verfügbar (z.B. intraperitoneale Lymphknoten)

Die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung ist ein Verfahren, bei dem Zellen mithilfe von Fluoreszenz-markierten Antikörpern markiert werden und durch Anlegen einer Spannung an einem elektrischen Feld spezifisch abgelenkt und aufgefangen werden können. Dadurch ist es möglich, Lymphomzellen zu identifizieren und aus der Zellsuspension heraus zu isolieren und anzureichern.

In einer vorläufigen Studie haben wir 30 verschiedene Patientenproben mit kleinen B-NHL-Klonen Sorter-angereichert. Nach einer Anreicherung der malignen B-Zellen auf 17% der Leukozyten (Median) in einer Gesamtzellzahl von 700.000 Zellen (Median) konnten wir zuverlässig NGS (lymphatisches Panel) durchführen. Dabei wurden in 50% der untersuchten Proben Lymphom-relevante Mutationen gefunden. Als Referenz wurden die NGS Analysen auch an der jeweiligen ungesorteten Patientenprobe durchgeführt. Ohne vorherige Anreicherung der Lymphomzellen wurden Mutationen nur in 13% der Fälle gefunden, wobei nur eine der ungesorteten Proben (3%) vollständig alle Mutationen aufzeigte.

Diese Daten zeigen die Notwendigkeit einer Anreicherung der malignen B-Zellen bei B-NHL Proben mit geringer Klon-Größe. Die Sorter-basierte Anreicherung stellt eine ideale Methode dar, um diese diagnostische Herausforderung zu meistern. Wir erweitern derzeit die Anzahl an Testproben (n>30), um zeitnah dieses Verfahren zu validieren und, in diagnostisch relevanten Einzelfällen, NGS-Analysen für B-Zelllymphome mit kleiner Klongröße zuverlässig anbieten zu können. Dafür haben wir derzeit zwei Sorter Geräte (CytoFlex SRT, Beckman Coulter) zur Verfügung.