Molekulargenetik

State-of-the-art Methoden zur Identifikation von Genmutationen mit höchster Sensitivität, Erstellung von genetischen Tumorprofilen und Bestimmung der minimalen Resterkrankung (MRD).

Um molekulargenetische Untersuchungen durchführen zu können, wird aus Zellen, je nach angeforderter Analyse, DNA oder RNA isoliert. Nachfolgend stehen verschiedene PCR-basierte Methoden zur Verfügung, um einzelne Genmutationen oder ganze Gen-Panel zu untersuchen.

Mögliches Untersuchungsmaterial
  • Knochenmark
  • Peripheres Blut
Bearbeitungszeit

3-10 Tage

DNA/RNA Extraktion und cDNA-Synthese

Bedeutung

Um molekulargenetische Untersuchungen durchführen zu können, wird aus Zellen, je nach angeforderter Analyse, DNA oder RNA isoliert. Die RNA wird anschließend in cDNA umgeschrieben.

Untersuchungsmaterial

Die aus dem eingeschickten Patientenmaterial (z.B. Knochenmark oder peripheres Blut) gewonnenen, aliquotierten Zellen werden für die DNA oder RNA Extraktion verwendet.

Methodik

Um Nukleinsäuren (DNA oder RNA) isolieren zu können, werden die Zellen in einem ersten Schritt in Lysepuffer resuspendiert. Dieser zerstört die Zellmembranen der Leukozyten, wodurch die Nukleinsäuren aus den Zellen frei gesetzt und gleichzeitig stabilisiert werden. Nun werden magnetische Kügelchen (magnetic beads) zugegeben, an deren Oberfläche die DNA- oder RNA-Moleküle binden. Die magnetischen Kügelchen mit den daran angehefteten Nukleinsäuren werden mithilfe eines Magneten an einer Seite des Reaktionsgefäßes immobilisiert und die restliche Flüssigkeit kann so leicht abgetrennt werden. Verbleibende Proteine und Zelltrümmer werden anschließend durch einige Waschschritte komplett entfernt. Die so aufgereinigten Nukleinsäuren müssen nun nur noch in einem letzten Schritt von den magnetischen Kügelchen eluiert werden. Dieser gesamte Vorgang läuft komplett automatisiert ab mit bis zu 96 Proben gleichzeitig.

Die so gewonnene DNA kann direkt für verschiedene molekulargenetische Analysen, wie z.B. NGS, verwendet werden. Dagegen muss die isolierte RNA in einem weiteren Schritt, der reversen Transkription, zunächst in die sehr viel stabilere cDNA (complementary DNA) umgewandelt werden. Das virale Enzym Reverse Transkriptase, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, übersetzt dabei die RNA in DNA. Wie jede Polymerase benötigt auch die Reverse Transkriptase einen Primer als Startpunkt für die Synthese. Es werden entweder Gen-spezifische Primer oder eine Mixtur aus zufälligen Primern (Oligonukleotide bestehend aus sechs zufällig zusammengesetzten Nukleinbasen) verwendet. So entsteht zunächst ein Hybrid-Strang bestehend aus RNA und DNA. Der RNA-Strang wird enzymatisch abgebaut und die resultierende einzelsträngige cDNA wird anschließend mithilfe einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase nach den Prinzipien einer klassischen PCR (s. Abschnitt PCR) in einen Doppelstrang umgesetzt und weiter vervielfältigt. Im Vergleich zur genomischen DNA enthält die cDNA keine Introns und ist somit beispielsweise bestens geeignet für den Nachweis von Fusionstranskripten, da die Bruchpunkte auf genomischer Ebene meist zu weit streuen. Zudem kann mittels cDNA die Expression bestimmter Gene analysiert werden.

Next Generation Sequencing (NGS)

Bedeutung

Die zunehmende Vielfalt klinisch relevanter molekularer Marker stellt die hämatologische Diagnostik vor große Herausforderungen. Mit Einführung moderner Hochdurchsatz-Sequenzierungsverfahren, auch Next Generation Sequencing (NGS) genannt, können heute parallel hunderttausende Genombereiche innerhalb kürzester Zeit mit sehr hoher Sensitivität analysiert werden. Dies eröffnet neue Möglichkeiten bei der Mutationsanalyse und für die Verlaufskontrolle hämatopoetischer Neoplasien. NGS wird heute beispielsweise bei CML-Patienten zur BCR-ABL1-Mutationsanalyse oder zur Erstellung umfassender genetischer Profile im Rahmen der Diagnose und Prognose von AML oder MDS eingesetzt.

Untersuchungsmaterial

Die NGS-Analyse kann aus jedem Material durchgeführt werden. Für die Untersuchung werden 5 bis 10 ml antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) Knochenmark bzw. peripheres Blut benötigt. Peripheres Blut ist als Untersuchungsmaterial ausreichend, sofern eine Ausschwemmung maligner Zellen vorliegt. Entsprechend sollte bei fehlender Ausschwemmung Knochenmark untersucht werden.

Methodik

Next Generation Sequencing ermöglicht eine immense Parallelisierung des Sequenzierungsprozesses. Für die Routine-Diagnostik ist die Methode des Amplicon Deep Sequencing oder die Targeted Enrichment basierte Methode besonders geeignet. Je nach Entität können mit dieser Methode relevante Genabschnitte mit hoher Sensitivität (1-3% Mutationslast) sequenziert werden. Das sog. Panel Testing erlaubt die Analyse mehrerer hundert Gene oder genetischen Hot-Spots in einem Testdurchlauf in weniger als einer Woche. Die Ergebnisse werden mittels komplexer Datenverarbeitung ausgewertet und Sequenzvarianten mit SNP- und Mutations-Datenbanken abgeglichen. 

Mehrere moderne NGS-Plattformen stehen für die Routine-Diagnostik zur Verfügung, beispielsweise von Illumina oder Thermo Fisher.

Zertifizierung

Das MLL ist ein von Illumina "Propel-zertifiziertes Labor". Mit dieser Zertifizierung wird unsere Expertise im Next-Generation Sequencing im Bereich genetischer und genomischer Forschung deutlich.

PCR (Polymerase-Kettenreaktion)

Bedeutung

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dient der Amplifikation, also Vervielfältigung, eines bestimmten Zielgen-Bereichs. So kann zum Beispiel die Anwesenheit eines Fusionstranskriptes, das durch chromosomale Rearrangements entsteht, durch die exponentielle Anreicherung dieser spezifischen Ziel-Sequenz in einer Patientenprobe nachgewiesen werden.

Untersuchungsmaterial

Für den Nachweis von Fusionstranskripten mittels PCR wird cDNA benötigt. Diese wird aus RNA synthetisiert, die aus dem eingeschickten Patientenmaterial isoliert wurde. Für die Analyse werden 5 bis 10 ml antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) Knochenmark bzw. peripheres Blut benötigt. Peripheres Blut ist als Untersuchungsmaterial ausreichend, sofern eine Ausschwemmung maligner Zellen vorliegt. Entsprechend sollte bei fehlender Ausschwemmung Knochenmark untersucht werden.

Methodik

Für die Durchführung einer PCR sind neben der Ziel-Sequenz, die den zu vervielfältigenden Bereich enthält, außerdem zwei sogenannte Oligonukleotid-Primer erforderlich. Diese werden so gewählt, dass sie die gewünschte Ziel-Sequenz flankieren. Sie dienen somit als Startpunkte für die Polymerase, einem thermostabilen Enzym, das unter Zugabe einer Mischung der einzelnen Nukleotide (Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin) einen einzelsträngigen Strang kopieren kann.
Eine PCR gliedert sich in drei Schritte, die sich durch unterschiedliche Temperaturen ausweisen. Zunächst erfolgt der Denaturierungs-Schritt bei ca. 95°C, bei dem der Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufgetrennt wird. Im anschließenden Anlagerungs-Schritt binden die Oligonukleotid-Primer an den Einzelstrang. Dabei wird die Temperatur in Abhängigkeit der Basenzusammensetzung der beiden Primer gewählt. In einem letzten Schritt, der sog. Elongation, kopiert die Polymerase, ausgehend von den gebundenen Primern, bei 72°C, dem Temperaturoptimum dieses Enzyms, die einzelsträngige Vorlage. Anschließend erfolgt wiederum ein Denaturierungsschritt und der Ablauf beginnt von neuem, wobei diese Zyklen je nach Anwendung 35 – 45x durchlaufen werden. Unter optimalen Bedingungen erfolgt pro Zyklus eine Verdoppelung der vorhandenen PCR-Produkte. Anschließend werden die PCR-Produkte mittels einer Kapillargelelektrophorese analysiert. Dabei durchwandern die Amplifikate eine dünne Kapillare, gefüllt mit einem Polymer, wobei die Laufgeschwindigkeit abhängig von der Länge des PCR-Produktes ist. Mithilfe eines mitlaufenden internen Größenstandards kann die Größe des Amplifikates bestimmt werden. Durch die Anwesenheit eines PCR-Produktes der erwarteten Größe kann so der Nachweis eines bestimmten Fusionstranskriptes erbracht werden.

Quantitative Real-Time PCR

Bedeutung

Eine weitere Methode für die Amplifikation und Detektion von PCR-Produkten ist die quantitative real-time (= Echtzeit) PCR. Im Gegensatz zu anderen Detektionsmethoden handelt es sich nicht um eine qualitative Endpunktanalyse, die eine Antwort auf die Frage liefert, ob einer Veränderung vorhanden ist, sondern um eine Bestimmung, wie viel von der Zielsequenz vorhanden ist.

Untersuchungsmaterial

Die quantitative real-time PCR kann aus jedem Material durchgeführt werden. Für die Analyse werden 5 bis 10 ml antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) Knochenmark bzw. peripheres Blut benötigt. Peripheres Blut ist als Untersuchungsmaterial ausreichend, sofern eine Ausschwemmung maligner Zellen vorliegt. Entsprechend sollte bei fehlender Ausschwemmung Knochenmark untersucht werden.

Methodik

Die Methode basiert auf dem Einsatz von spezifischen Fluoreszenz-markierten Sonden, die zusätzlich zu den für die PCR benötigten Primern in den Reaktionsansatz gegeben werden. Diese Sonden hybridisieren während der laufenden PCR mit den sich ständig vermehrenden Amplifikationsprodukten und geben Fluoreszenz-Signale ab, die von einer optischen Einheit detektiert werden. Bei Vorhandensein der spezifischen Zielsequenz kommt es zu einem Anstieg der Fluoreszenzintensität während der PCR. Der Punkt (PCR-Zyklus), bei dem eine über dem Grundrauschen liegende Fluoreszenz detektierbar ist, korreliert mit der Anzahl der nachzuweisenden Moleküle im Ausgangsmaterial. Dies wird anhand einer mitgeführten Verdünnungsreihe mit bekannten Konzentrationen ermittelt (Standardkurve oder Kalibrationskurve). Die Anzahl der nachgewiesenen Moleküle des untersuchten Gens wird gegen die eines konstant vorliegenden Gens oder Transkriptes in Relation gesetzt (Normalisierung). Dies ermöglicht, die Zahl der im Ausgangsmaterial vorhandenen malignen Zellen zu bestimmen und in verschiedenen Proben zu vergleichen.

Der qualitative Nachweis einer Zielsequenz ist mittels real-time PCR grundsätzlich auch möglich. Die Stärke dieser Methode liegt jedoch bei der Bestimmung der Krankheitslast bei Verlaufsuntersuchungen z.B. unter Therapie. Durch die genaue Quantifizierung des zu untersuchenden Gens kann der Therapierfolg und das Therapieversagen gemessen werden. Bei der real-time PCR werden zudem sehr hohe Sensitivitäten erreicht, so dass – je nach Art der Veränderung und des Ausgangsmaterials – eine maligne Zelle in 104 bis 105 normalen Zellen nachgewiesen werden kann.

Digitale PCR

Bedeutung

Neben der quantitativen real-time PCR ist die digitale PCR (dPCR) eine alternative Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung einer spezifischen Zielsequenz. Sie eignet sich besonders gut für Verlaufskontrollen von Patienten unter Therapie, um den Erfolg bzw. das Versagen sensitiv bestimmen zu können, ohne eine Standardisierung zu benötigen.

Untersuchungsmaterial

Die digitale PCR kann aus jedem Material durchgeführt werden. Für die Analyse werden 5 bis 10 ml antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) Knochenmark bzw. peripheres Blut benötigt. Peripheres Blut ist als Untersuchungsmaterial ausreichend, sofern eine Ausschwemmung maligner Zellen vorliegt. Entsprechend sollte bei fehlender Ausschwemmung Knochenmark untersucht werden.

Methodik

Die digitale PCR beruht auf der Partitionierung des PCR-Ansatzes. Dies kann entweder in Tröpfchen (droplets) oder array-basiert erfolgen. Die eingesetzte DNA wird zufällig in die einzelnen Reaktionsräume verteilt, sodass einige keine und andere eine oder mehrere Kopien der Zielsequenz enthalten. Anschließend erfolgt die Amplifikation der Zielsequenz mittels Endpunkt-PCR. Die Fluoreszenzintensität der einzelnen Reaktionsräume wird erfasst, um den Anteil der positiven Partitionen zu bestimmen. Hiermit wird die Ausgangskonzentration der Zielsequenz berechnet. Die Anzahl an Kopien mit der spezifischen Mutation wird zu derer mit entsprechender Wildtyp-Sequenz ins Verhältnis gesetzt. Da die Quantifizierung mittels des ja/nein Prinzips geschieht, ist keine Kalibrierung und Standardkurve notwendig und es kann die absolute Kopienanzahl des amplifizierten Genabschnitts im Ausgangsmaterial bestimmt werden.

Bei dem in unserem Labor verwendeten droplet dPCR-System (ddPCR) erfolgt die Kompartimentierung des PCR-Ansatzes in bis zu 20 000 Einzelreaktionen. In Wasser-Öl-Tröpfchen findet die Amplifikation der Zielsequenz statt. Die Sensitivität beträgt in der Regel zwischen 0,005 - 0,05% je nach Zielsequenz.

Fragmentanalyse

Bedeutung

Die Fragmentanalyse (auch Genescan genannt) ist ein fluoreszenzbasiertes, molekulardiagnostisches Analyseverfahren zur Längenbestimmung von Nukleinsäuresequenzen. Sie ermöglicht neben der hochauflösende Detektion von Größenunterschieden bei PCR Amplifikaten (z.B. Insertionen, Deletionen, Duplikationen, Fusionsgenen) die quantitative Bestimmung einer Mutation im Verhältnis zu ihrem gesunden Allel. Im Rahmen der molekulargenetischen Diagnostik werden Fragmentanalysen zur Identifizierung von prognostischen und krankheitsauslösenden Mutationen bei verschiedenen hämatologischen Neoplasien verwendet. Darüber hinaus finden Fragmentanalysen bei der Chimärismusanalyse sowie zur Klonalitätsanalyse Anwendung.

Untersuchungsmaterial

Die Fragmentanalyse kann aus jedem Material durchgeführt werden. Für die Analyse werden 5 bis 10 ml mit antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) peripheres Blut bzw. Knochenmark benötigt. Peripheres Blut ist als Untersuchungsmaterial ausreichend, sofern eine Ausschwemmung maligner Zellen vorliegt. Entsprechend sollte bei fehlender Ausschwemmung Knochenmark untersucht werden.

Methodik

Die Fragmentanalyse beruht auf dem Funktionsprinzip der Polymerase Kettenreaktion (PCR). Im Gegensatz zur klassischen PCR werden für die Fragmentanalyse sequenzspezifische Primerpaare eingesetzt, von denen einer der beiden Primer mit einer Fluoreszenzmarkierung versehen ist. Die anschließende Auftrennung der PCR-Amplifikate erfolgt in einem Kapillarsequenzer. Durch das Hinzufügen eines fluoreszenzmarkierten Längenstandards ist im Gegensatz zur Gelelektrophorese eine Größenunterscheidung von PCR-Produkten selbst dann möglich, wenn sich diese nur um ein Basenpaar voneinander unterscheiden. Darüber hinaus ermöglicht die gleichzeitige Verwendung von mehreren mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten Primerpaaren in einem Multiplex PCR Ansatz die parallele Größenbestimmung von verschiedenen Zielsequenzen.

Klonalitätsanalyse

Bedeutung

Die Klonalitätsanalyse bezeichnet ein molekulardiagnostisches Nachweisverfahren zur Detektion von lymphoproliferativen Erkrankungen. Während der B- und T-Zellentwicklung kommt es zu einer genomischen Neuanordnung, der für die Antigenrezeptoren auf B- und T-Zellen kodierenden Genabschnitte, die als V-(D)-J Genrearrangement bezeichnet wird. Die gesunde polyklonale lymphatische Hämatopoese umfasst eine Vielzahl von unterschiedlichen lymphatischen Zellklonen, die sich jeweils in ihrer Antigenspezifität und dem genomischen Rearrangement der V-(D)-J Region voneinander unterscheiden. In Patienten mit lymphoproliferativen Erkrankungen kommt es zu einer Verdrängung und Überlagerung der gesunden polyklonalen Hämatopoese durch die unkontrollierte Vermehrung eines (monoklonal), zweier (biklonal) oder mehrerer (oligoklonal) maligner lymphatischer Zellklone. Mit Hilfe der PCR-Fragmentanalyse lassen sich Größe und Häufigkeit von genomischen Rearrangements in der V-(D)-J Region des Antigenrezeptors analysieren und das Vorhandensein eines dominanten Zellklons innerhalb der lymphatischen Zellpopulation identifizieren. Allerdings ist eine Aussage über die Malignität des Zellklons auf Grundlage der Molekulargenetik nicht möglich und erlaubt nur selten eine eindeutige Unterscheidung zwischen einer mono-, bi- oder oligoklonalen Zellpopulation.

Neben der Diagnosestellungen von lymphoproliferativen Erkrankungen ermöglichen Klonalitätsanalysen mit einer Sensitivität von ca. 5% die Kontrolle des Therapieerfolgs im Krankheitsverlauf. Darüber hinaus kann sich an die Klonalitätsanalyse die Etablierung einer patienten-spezifischen Quantifizierung der minimalen Resterkrankung (MRD) anschließen, um eine Sensitivität von ca. 0,01-0,001% zu ermöglichen. Hier wird sich zu Nutze gemacht, dass die Basenpaarabfolge in der genomischen Region des B- und T-Zell-Rezeptors hochspezifisch für den jeweiligen Zellklon ist.

Untersuchungsmaterial

Klonalitätsanalysen können aus jedem Probenmaterial durchgeführt werden. Für die Analyse werden 5 bis 10 ml antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) Knochenmark bzw. peripheres Blut benötigt. Peripheres Blut ist als Untersuchungsmaterial ausreichend, sofern eine Ausschwemmung maligner Zellen vorliegt. Entsprechend sollte bei fehlender Ausschwemmung Knochenmark untersucht werden.

Methodik

Klonalitätsanalysen basieren methodisch auf der PCR Fragmentanalyse. Bei der PCR Fragmentanalyse handelt es sich um ein hochauflösendes molekulardiagnostisches Nachweisverfahren zur selektiven Amplifikation und Größenauftrennung von Nukleinsäuren. Im Rahmen von Klonalitätsanalysen werden genomische V-(D)-J Genrearrangements unter Verwendung von verschiedenfarbigen, fluoreszenzmarkierten Primerpaaren in einer Multiplex PCR sequenzspezifisch amplifiziert und auf einem Kapillarsequencer aufgetrennt. Die Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Längenstandards erlaubt es, klonale V-(D)-J Genrearrangements anhand ihrer Farbe und Amplifikatgröße zu identifizieren und von dem polyklonalen Hintergrund abzugrenzen.

Chimärismusanalyse

Bedeutung

In der Hämatologie dient die Chimärismus-Analyse dem Nachweis und der Quantifizierung von Spender- und Empfänger-Hämatopoese nach allogener Stammzelltransplantation. In der Transplantationsmedizin bezeichnet der Begriff Chimäre einen Organismus, der die DNA von zwei unterschiedlichen Organsimen in sich trägt. Dies ist der Fall, wenn das hämatopoetische System eines Patienten von einem anderen Menschen abstammt. Mit der Überwachung des Chimärismus lässt sich ein Transplantatversagen oder ein Rezidiv frühzeitig erkennen.
Ein kompletter Chimärismus liegt vor, wenn alle blutbildenden Zellen vom Spender stammen. Bei einem gemischten Chimärismus lassen sich sowohl Blutzellen vom Spender als auch vom Empfänger nachweisen. Bei der Verwendung von Gesamt-Knochenmark oder Blut liegt die Sensitivität der Untersuchung bei 2-5%.

Untersuchungsmaterial

Für die Analyse werden 5 bis 10 ml antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) Knochenmark bzw. peripheres Blut benötigt. Peripheres Blut ist als Untersuchungsmaterial ausreichend, sofern eine Ausschwemmung maligner Zellen vorliegt. Entsprechend sollte bei fehlender Ausschwemmung Knochenmark untersucht werden.

Zusätzlich wird als Referenzproben einmalig mindestens einer der folgenden Materialien benötigt.

  • Knochenmark oder Blut des Patienten vor Transplantation

  • Mundschleimhaut- oder Nagelmaterial des Patienten

  • Probe (z.B. Blut) des Spenders

Methodik

Die Chimärismus-Analyse erfolgt anhand der Bestimmung sogenannter Short tandem repeat (STR)-Polymorphismen. Short tandem repeats sind kurze Sequenzwiederholungen von nur wenigen Basenpaaren (STR-Motiv) und treten in zumeist nicht-kodierenden Bereichen der DNA auf. Die Anzahl der Wiederholungen an einer bestimmten Stelle (Locus) der DNA kann zwischen verschiedenen Individuen variieren. Mittels PCR basierter Amplifizierung und anschließender Fragmentanalyse wird die Länge der beiden STR-Allele für die untersuchten Loci eines Individuums bestimmt. Als Ergebnis werden die Anzahl der Wiederholungen des STR-Motivs angegeben. In einem Multiplex PCR Ansatz können mehrere solcher STR-Loci amplifiziert werden. Die Kombination der Anzahl an Sequenzwiederholungen an unterschiedlichen Loci liefert ein individuelles genetisches Profil. Ein STR-Locus bzw. Marker wird als informativ bezeichnet, wenn der Empfänger mindestens ein Allel aufweist, bei dem keine Übereinstimmung mit den Spender-Allelen vorliegt.

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Untersuchungsauftrag

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Untersuchungsauftrag Pharmakogenetik

Auftrag zur CE-IVD zertifizierten DPD-Testung. Nachdem diese Analyse unter das Gendiagnostikgesetz (GenDG) fällt, ist die benötigte Einverständniserklärung integriert und muss mitausgefüllt und vom Patienten unterschrieben eingereicht werden.

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Patienteneinwilligung

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GenDG-Einverständniserklärung

Das Gendiagnostikgesetz (GenDG) fordert für alle genetischen Analysen eine ausführliche Aufklärung und eine schriftliche Einwilligung.

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WGS-Einverständniserklärung

Mit dieser Patienteneinwilligung erklären Sie sich damit einverstanden, dass überschüssiges Biomaterial für Forschungszwecke und hier im Speziellen für eine Ganz-Genom-Sequenzierung (WGS) verwendet wird.

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Dr. rer. nat. Manja Meggendorfer, MBA

Diplombiologin
Leitung des Bereichs Molekulargenetik
Leitung Forschung und Entwicklung

T: +49 89 99017-355