Fluoreszenz in situ
Hybridisierung (FISH)
Identifizierung bekannter Chromosomen- bzw. Genaberrationen sowohl an Metaphasen-Chromosomen als auch an Interphasen-Kernen mit Fluoreszenz-Sonden.
- Knochenmark
- Peripheres Blut
1-3 Tage
Für Verlaufskontrollen unter Therapie kann die FISH-Technik als Methode zum Nachweis von Resterkrankung verwendet werden, sofern bei Erstdiagnose mittels Chromosomenanalyse eine Veränderung gefunden wurde, für deren Nachweis entsprechende FISH-Sonden zur Verfügung stehen. Die Sensitivität dieser Methode ist höher als bei der Chromosomenanalyse, jedoch deutlich geringer als die der Polymerase-Ketten-Reaktion oder Immunphänotypisierung.
Untersuchungsmaterial
Für die FISH-Analyse werden 5 bis 10 ml mit Heparin antikoaguliertes Knochenmark bzw. peripheres Blut benötigt. Alternativ kann EDTA oder Citrat als Antikoagulans verwendet werden. Peripheres Blut ist als Untersuchungsmaterial ausreichend, sofern eine Ausschwemmung maligner Zellen vorliegt. Entsprechend sollte bei fehlender Ausschwemmung Knochenmark untersucht werden.
Methodik
Spezifische Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden
Die FISH-Technik beruht auf der Hybridisierung von DNA-Sonden, die spezifische chromosomale Strukturen identifizieren. Es können Sonden verwendet werden, die spezifisch die Zentromer-Region einzelner Chromosomen, Gene oder ganze Chromosomen markieren. Die DNA der eingesetzten Sonden und die zu untersuchende Patienten-DNA werden denaturiert, d.h. die beiden DNA-Stränge der Doppelhelix werden getrennt. Bei der anschließenden Renaturierung lagern sich die DNA-Sonden an die komplementären Abschnitte der Patienten-DNA an (Hybridisierung). Die DNA-Sonden sind direkt mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert. Die entsprechenden Chromosomenstrukturen sind somit als Fluoreszenz-Signale auswertbar.
Vor- und Nachteile von FISH
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Vorteile |
Limitationen |
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An
Metaphasen und Interphasen-Kernen (hierfür keine Zellteilung erforderlich)
durchführbar. |
Nur Informationen über die Chromosomen/Gene möglich, für welche die Sonden eingesetzt wurden. |
Interphasen-FISH
Zur gezielten Ergänzung der Chromosomenanalyse, zum Screening z.B. bei der CLL und dem multiplen Myelom und im Verlauf kann man FISH an Interphase Kerne durchführen. Die FISH-Technik eignet sich vor allem zum Nachweis sogenannter submikroskopischer Veränderungen, die unterhalb des Auflösungsbereichs der Chromosomenanalyse liegen, wie z.B. sehr kleine Deletionen, wie sie bei der CLL vorkommen oder bei sehr kleinen Insertionen, die bei einem kleinen Teil der Patienten mit Fusionsgenen beobachtet werden.
Für Verlaufskontrollen unter Therapie kann die FISH-Technik als Methode zum Nachweis von Resterkrankung allerdings nur dann verwendet werden, wenn bei Erstdiagnose mittels Chromosomenanalyse eine Veränderung gefunden wurde, für deren Nachweis entsprechende FISH-Sonden zur Verfügung stehen. Die Sensitivität der Interphasen-FISH ist höher als bei der Chromosomenanalyse, jedoch deutlich geringer als die der Polymerase-Ketten-Reaktion und Immunphänotypisierung.
Metaphasen-FISH
Zusätzlich zu den an Interphase-Kernen einsetzbaren Sonden können an Metaphasen sogenannte Chromosomen-Painting-Sonden eingesetzt werden, die spezifisch die gesamte DNA eines Chromosoms markieren. Diese Technik wird vor allem zur Bestätigung der Chromosomenanalyse bei schwierigen Fällen eingesetzt. Sie kann auf den gleichen Metaphasen nach der Bänderungsanalyse ausgeführt werden.
24-Farben-FISH
Die Methode 24-Farben-FISH erlaubt es, alle 22 verschiedenen Chromosomenpaare sowie das X- und das Y-Chromosom in einer einzigen Hybridisierung darzustellen. Sie ist nur an Metaphasechromosomen durchführbar und dient zur Identifizierung von komplizierten Strukturaberrationen. Sie kann ebenso auf den gleichen Metaphasen nach der Bänderungsanalyse ausgeführt werden.
Nomenklatur
ISCN für FISH an Interphasen-Kernen
Nach der ISCN-Nomenklatur (International System for Human Cytogenetic Nomenclature) wird ein Interphase-FISH Befund mit „nuc ish“ für „nuclear in situ hybridization“ begonnen. In der Formel wird die verwendete Sonde spezifiziert durch die Chromosomenbande in der sie lokalisiert ist, sowie durch ihre genaue Bezeichnung: entweder als Name eines Gens oder als Bezeichnung eines anonymen Locus. Der Formel ist ferner zu entnehmen, wie viele Signale einer spezifischen Sonde beobachtet wurden und ggfs. ihre relative Position zu anderen untersuchten Sonden.
Wird mit einer Sonde für die Zentromer-Region von Chromosom 8 hybridisiert, lautet die ISCN-Formel im Falle eines Normal-Befundes (2 Chromosomen 8 pro Zellkern): nuc ish 8cen(D8Z2x2), im Falle einer Trisomie 8 (3 Chromosomen 8 pro Zellkern): nuc ish 8cen(D8Z2x3).
Wird mit Sonden hybridisiert, die die Bruchpunkte in den Genen RUNX1 und RUNX1T1 überspannen, die bei der t(8;21)(q22;q22)/RUNX1-RUNX1T1-Rearrangement betroffen sind, so lautet der ISCN-Befund bei Nachweis eines RUNX1-RUNX1T1-Rearrangements:
nuc ish 8q22(RUNX1T1x3),21q22(RUNX1x3),(RUNX1T1 con RUNX1x2).
Durch die Bruchereignisse im RUNX1-Gen und im RUNX1T1-Gen kommt es zu einer Splittung der Sonden und somit jeweils zu drei Signalen für RUNX1 und RUNX1T1: 8q22(RUNX1T1x3),21q22(RUNX1x3), jeweils ein RUNX1- und ein RUNX1T1-Signal liegen auf den beiden derivativen Chromosomen direkt nebeneinander (Kolokalisation): (RUNX1T1 con RUNX1x2).
Bei Nachweis einer Deletion z.B. im langen Arm von Chromosom 5 in der Bande 5q31 lautet der ISCN Interphase-FISH Befund: nuc ish 5q31(EGR1x1) – es findet sich nur ein Signal für EGR1 statt der üblichen zwei.
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Ihre Ansprechpartnerin
»Die Leukämiediagnostik wird immer umfangreicher, da die Therapie zunehmend individueller wird.«
Dr. rer. nat. Isolde Summerer
Diplombiologin
Bereichsleitung Zytogenetik
Stellv. Abteilungsleitung Chromosomenanalyse-Befundung
Stellv. Abteilungsleitung FISH-Befundung
isolde.summerer@mll.com