Nested PCR

Bedeutung

Mit dieser Methode kann sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität einer PCR weiter erhöht werden. In der Hämatologie wird sie häufig angewandt, wenn es um die Detektion einer sehr geringen Menge von Ausgangsmolekülen geht, also vor allem bei der Detektion minimaler Resterkrankung. Hierbei findet die nested PCR am häufigsten Anwendung im Nachweis von Fusionstranskripten, die durch ein chromosomales Rearrangement entstehen.

Untersuchungsmaterial

Die PCR-Untersuchung kann aus jedem Material durchgeführt werden. Für die Analyse werden 5 bis 10 ml antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) Knochenmark bzw. peripheres Blut benötigt. Peripheres Blut ist als Untersuchungsmaterial ausreichend, sofern eine Ausschwemmung maligner Zellen vorliegt. Entsprechend sollte bei fehlender Ausschwemmung Knochenmark untersucht werden.

Methodik

Für eine nested PCR wird einer bereits durchgeführten ersten PCR ein kleiner Anteil entnommen und als Ausgangsmaterial für eine neue PCR eingesetzt. Als Primer werden hier Oligonukleotide verwendet, die innerhalb des ersten Amplifikates hybridisieren. Durch diese zusätzliche Amplifikation wird die Sensitivität sehr stark erhöht. Hiermit kann - je nach Art der Mutation und des Ausgangsmaterials - eine maligne Zelle in 104 bis 108 normalen Zellen nachgewiesen werden. Somit handelt es sich bei diesem Verfahren um die derzeit für die meisten Zielsequenzen sensitivste Methode zur Detektion minimaler Resterkrankung. Dieses Verfahren birgt aber aufgrund seiner hohen Sensitivität auch das höchste Kontaminationsrisiko. Um Kontaminationen zu vermeiden, müssen verschiedene Vorsichtsmaßnahmen zum Einsatz kommen sowie immer Kontrollreaktionen mitgeführt werden.

Quantitative Real-Time PCR

Bedeutung

Eine weitere Methode für die Amplifikation und Detektion von PCR-Produkten ist die quantitative real-time PCR. Hierbei handelt es sich nicht wie bei den anderen Detektionsmethoden um eine qualitative Endpunktanalyse, sondern es wird in Echtzeit (real-time) während der Vermehrung der PCR Produkte gemessen. Die Analyse der logarithmischen Phase dieser Amplifikation ermöglicht eine genaue Quantifizierung der Zielsequenzen im Untersuchungsmaterial.

Untersuchungsmaterial

Die quantitative real-time PCR kann aus jedem Material durchgeführt werden. Für die Analyse werden 5 bis 10 ml antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) Knochenmark bzw. peripheres Blut benötigt. Peripheres Blut ist als Untersuchungsmaterial ausreichend, sofern eine Ausschwemmung maligner Zellen vorliegt. Entsprechend sollte bei fehlender Ausschwemmung Knochenmark untersucht werden.

Methodik

Die Methode basiert darauf, dass zusätzlich zu den für die PCR benötigten spezifischen Primern Fluoreszenz-markierte Sonden in den Reaktionsansatz gegeben werden. Diese hybridisieren während der laufenden PCR mit den sich ständig vermehrenden Amplifikationsprodukten und geben dann Fluoreszenz-Signale ab, die von einer optischen Einheit detektiert werden. Es kommt so direkt während der PCR bei Vorhandensein der spezifischen Zielsequenz zu einem Anstieg der Fluoreszenzintensität. Der Punkt (PCR-Zyklus), bei dem in einer Probe erstmals eine über dem Grundrauschen liegende Fluoreszenz detektierbar wird, korreliert mit der Anzahl der nachzuweisenden Moleküle im Ausgangsmaterial. Die Anzahl der nachgewiesenen Moleküle des zu untersuchenden Gens werden gegen die eines konstant vorliegenden Gens oder Transkriptes in Relation gesetzt (normalisiert), wonach die Zahl der im Ausgangsmaterial vorhandenen malignen Zellen kalkuliert werden kann. Für dieses Detektionsverfahren ist der Einsatz von speziellen PCR-Geräten erforderlich, die mit optischen Einheiten ausgestattet sind. Mit dieser Methode kann zwar auch der normale Nachweis eines PCR Produktes erfolgen, die Stärke der real-time PCR liegt jedoch insbesondere bei Verlaufsuntersuchungen, z.B. unter Therapie, in der Möglichkeit der genauen Quantifizierung und ist somit ein Werkzeug zur Messung des Therapieerfolges. Auch bei der real-time PCR werden sehr hohe Sensitivitäten erreicht, so dass – je nach Art der Mutation und des Ausgangsmaterials – eine maligne Zelle in 104 bis 105 normalen Zellen nachgewiesen werden kann.

Sequenzanalyse (nach Sanger)

Bedeutung

Eine zielgerichtete Diagnostik erfordert in vielen Fällen die Bestimmung der genauen Basenabfolge eines Genabschnitts mittels einer Sequenzanalyse.

Untersuchungsmaterial

Die Sequenzanalyse kann aus jedem Material durchgeführt werden. Für die Untersuchung werden 5 bis 10 ml antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) Knochenmark bzw. peripheres Blut benötigt. Peripheres Blut ist als Untersuchungsmaterial ausreichend, sofern eine Ausschwemmung maligner Zellen vorliegt. Entsprechend sollte bei fehlender Ausschwemmung Knochenmark untersucht werden.

Methodik

Bei der Sequenzanalyse nach der sogenannten Sanger Methode, werden Sequenzierungsreaktionen durchgeführt, bei denen in einer PCR-basierten Reaktion Nukleotide eingebaut werden. Dabei ist jedes der vier unterschiedlichen Nukleotide mit einem anderen Fluoreszenz-Farbstoff und einer Dideoxygruppe markiert und führt über diese zu einem Kettenabbruch der PCR-Reaktion. Anschließend werden die Produkte über eine Matrix, die z. B. ein Gel oder ein Polymer sein kann, nach Länge aufgetrennt und über eine optische Einheit gelesen, so dass die genaue Basenabfolge einer Sequenz bestimmt werden kann.
Für einzelne Genabschnitte bei einer limitierten Anzahl von Patienten sind Sanger-Sequenzierungen als Primärmethode durchführbar. Die Nachweisgrenze (Sensitivität) dieser Methode liegen bei 10-20% Mutationslast. Sollen bei einem Patienten mehrere Regionen untersucht werden oder bestimmte Gene bei einer sehr großen Anzahl von Patienten gescreent werden, kann die direkte Sequenzierung sehr mühsam und kostenintensiv werden. Hier bieten sich unterschiedliche Screeningverfahren an, um festzustellen, ob in bestimmten Genabschnitten eine Mutation vorliegt, ohne dass schon die genaue Sequenz ermittelt wird (z.B. Fragmentlängen- oder Schmelzkurven-Analysen). Alternativ kann die Mutationsanalyse auch mittels „Next Generation Sequencing“ durchgeführt werden, das einen deutlich höheren Durchsatz erlaubt.  

Next Generation Sequencing (NGS)

Bedeutung

Die zunehmende Vielfalt klinisch relevanter molekularer Marker stellt die hämatologische Diagnostik vor große Herausforderungen. Mit Einführung moderner Hochdurchsatz-Sequenzierungsverfahren, auch Next Generation Sequencing (NGS) genannt, können heute parallel hunderttausende Genombereiche innerhalb kürzester Zeit mit sehr hoher Sensitivität analysiert werden. Dies eröffnet neue Möglichkeiten bei der Mutationsanalyse und für die Verlaufskontrolle hämatopoetischer Neoplasien. NGS wird heute beispielsweise bei CML-Patienten zur BCR-ABL1-Mutationsanalyse oder zur Erstellung umfassender genetischer Profile im Rahmen der Diagnose und Prognose von AML oder MDS eingesetzt.

Untersuchungsmaterial

Die NGS-Analyse kann aus jedem Material durchgeführt werden. Für die Untersuchung werden 5 bis 10 ml antikoaguliertes (Heparin, EDTA, Citrat) Knochenmark bzw. peripheres Blut benötigt. Peripheres Blut ist als Untersuchungsmaterial ausreichend, sofern eine Ausschwemmung maligner Zellen vorliegt. Entsprechend sollte bei fehlender Ausschwemmung Knochenmark untersucht werden.

Methodik

Next Generation Sequencing ermöglicht eine immense Parallelisierung des Sequenzierungsprozesses. Für die Routine-Diagnostik ist die Methode des Amplicon Deep Sequencing oder die Targeted Enrichment basierte Methode besonders geeignet. Je nach Entität können mit dieser Methode relevante Genabschnitte mit hoher Sensitivität (1-3% Mutationslast) sequenziert werden. Das sog. Panel Testing erlaubt die Analyse mehrerer hundert Gene oder genetischen Hot-Spots in einem Testdurchlauf in weniger als einer Woche. Die Ergebnisse werden mittels komplexer Datenverarbeitung ausgewertet und Sequenzvarianten mit SNP- und Mutations-Datenbanken abgeglichen.  

Mehrere moderne NGS-Plattformen stehen für die Routine-Diagnostik zur Verfügung, beispielsweise von Illumina oder Thermo Fisher.

Genomische Array Analysen

Bedeutung

Die Array-Technologie ist sinnvolle Ergänzung zur klassischen Zytogenetik. Array-basierte Kopienzahl-Analysen haben in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Die Anwendung dieser Methodik ermöglicht eine genomweite, hochauflösende Detektion von Zugewinnen und Verlusten chromosomalen Materials inklusive zytogenetisch kryptischer Mikrodeletionen und Mikroduplikationen. Ebenso können Bruchpunkte und unbekannte Fusionspartnergene bei unbalancierten Translokationen identifiziert und charakterisiert werden. Ferner ist auch der Nachweis eines Kopien-neutralen Verlustes der Heterozygotie möglich („copy-neutral loss of heterozygosity“, CN-LOH). Häufig werden für genomische Array Analysen auch die Begriffe Array-CGH (Array basierte comparative genomische Hybridisierung) und SNP-Array („single nucleotide polymorphism“ basierter Array) verwendent.
Da die Detektion von balancierten Translokationen oder intrachromosomalen Rearrangements ohne Kopienzahl-Veränderungen nicht möglich ist, ist die Array-Technologie eine sinnvolle Ergänzung zur Chromosomenanalyse und Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH), kann die beiden anderen Techniken jedoch nicht ersetzen. Die Array-Technologie findet als ergänzende Methode vor allem ihren Einsatz bei Patienten mit zytogenetisch unauffälligem Befund oder bei sehr komplexen Karyotyp-Veränderungen.

Tabelle 1: Vorteile und Nachteile von CGH Microarray-Analysen

Vorteile

Limitationen

Überblick über das gesamte Genom bzgl. Zugewinnen und Verlusten

Balancierte Rearrangements nicht detektierbar

Unabhängig von der Proliferation der malignen Zellen

Kleine Klone (<15%) nicht sicher detektierbar

Sehr hohe Auflösung

 

Kopien-neutraler LOH nachweisbar

 

Untersuchungsmaterial

Für die CGH-Array-Analyse werde 2-5 ml EDTA-Blut benötigt. Zusätzlich sollten 2-5 ml Heparin-Blut für die Karyotypisierung und FISH-Untersuchung zur Verfügung gestellt werden.

Methodik

Bei der genomischen Array-Analyse wird Patienten-DNA auf ein Array hybridisiert. Abhängig von der verwendeten Technologie kann die zusätzliche Hybridisierung einer Referenz-DNA erforderlich sein. Die Auflösung der genomischen Arrays variiert zwischen den verschiedenen Array-Plattformen und beträgt bei den von uns zurzeit eingesetzten Arrays ca. 100kb. Nach ca. 48 Stunden Hybridisierungsdauer werden die Arrays gescannt und mithilfe verschiedener bioinformatischer Algorithmen Veränderungen im Patientengenom charakterisiert.


Die im MLL für Forschungsprojekte eingesetzte genomische Array-Plattform ermöglicht zusätzlich zum Nachweis von genomischen Zugewinnen und Verlusten die Identifizierung von Regionen mit LOH ohne Veränderung der Kopienzahl („copy neutral loss of heterozygosity“ = CN-LOH). Frühe Studien haben gezeigt, dass in den Tumorzellen vorhandene CN-LOH-Regionen häufig bei AML, myeloproliferativen Neoplasien und myelodysplastischen Syndromen vorkommen und dass diese mit „loss-of-function“ Mutationen in Genen in der betroffenen CN-LOH-Region assoziiert sind. CN-LOH sind weder mittels Chromosomenanalyse noch mittels FISH detektierbar.

Kontakt

Dr. rer. nat. Manja Meggendorfer, MBA

MLL Münchner Leukämielabor GmbH
Max-Lebsche-Platz 31
81377 München

T: +49 (0)89 99017-355

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