Bedeutung

Der Begriff „Minimale Resterkrankung“ (minimal residual disease, MRD) bezeichnet eine bei Leukämiepatienten im Therapieverlauf oder nach Therapieende nachweisbare residuelle maligne Zellpopulation. Insbesondere in Patienten mit akuten Leukämien (AML und ALL) und lymphoproliferativen Erkrankungen gewinnt die klinische Diagnostik der MRD zunehmend an Bedeutung. Die Untersuchung der MRD besitzt prognostische Aussagekraft und ermöglicht die Früherkennung eines Rückfalls (Rezidiv) nach Therapieversagen. Sie ist somit hochrelevant für die Auswahl und Steuerung einer risikoadaptierten Therapie. Der Nachweis der MRD erfolgt in der Regel mit hochmodernen Analysetechniken aus dem Bereich der Molekulargenetik und Immunphänotypisierung, da diese eine hohe Sensitivität ermöglichen.

Methodik

Molekulargenetische Bestimmung der MRD

Der molekulargenetische Nachweis der MRD beruht auf dem Funktionsprinzip der Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR). Hierbei handelt es sich um ein enzymbasiertes Verfahren zur spezifischen Vervielfältigung von Nukleinsäuresequenzen. Zu den im Rahmen der molekulargenetischen MRD-Routinediagnostik verwendeten Analyseverfahren zählen u.a.: Next Generation Sequencing (NGS) mittels Ultra-Deep Amplicon Sequencing, digital PCR, quantitative real-time PCR (qPCR) und die Fragmentanalyse. In Abhängigkeit von der untersuchten Mutation und Technologie kann die Detektionsfähigkeit der MRD stark variieren. Aufgrund ihrer hohen Sensitivität – gemeint ist das Vermögen eine erkrankte Zelle innerhalb einer Population von gesunden Zellen aufzuspüren - ist die Molekulargenetik der konventionellen Zytomorphologie und Zytogenetik für den MRD-Nachweis zum Teil deutlich überlegen (siehe Tabelle 1).

Untersuchungsmethode

Sensitivität

(Positive Zellen/untersuchte Zellen)

Sensitivität

Zytomorphologie

5-10/100

5-10%

Klassische Zytogenetik

1-2/20

5-10%

FISH

1-5/100

1-5%

Fragmentanalyse

2-10/100

2-10%

Next Generation Sequencing

1-3/100

1-3%

Mulicolor Flow Cytometry (MFC)
 

1/10.000

0,01%

digital PCR
 

1/10.000

0,01%

quantitative real-time PCR
 

1/10-100.000

0,01-0,001%

Die molekulargenetische Bestimmung der MRD basiert auf dem Nachweis von leukämiespezifischen DNA-Sequenzvarianten, chromosomalen Translokationen und genomischen Rearrangements. Mit Hilfe von molekularbiologischen Untersuchungsmethoden können patientenspezifische Mutationen bei Diagnosestellung identifiziert und im Untersuchungsverlauf nachverfolgt werden. Ein Beispiel hierfür ist die Neuanordnung der für den B- und T-Zellrezeptor kodierenden Sequenzbereiche während der B- und T-Zellentwicklung. Mit Hilfe der PCR-Fragmentanalyse können im Rahmen von Klonalitätsanalysen bei Patienten mit akuten Leukämien und lymphoproliferativen Erkrankungen klonale Rearrangements der für den Antigenrezeptor auf B- und T-Zellen kodierenden V-(D)-J-Sequenzbereiche identifiziert und für die Generierung von patientenspezifischen Primern herangezogen werden. Der Nachweis eines klonalen Rezeptorrearrangements mittels qPCR erlaubt somit eine patientenspezifische Quantifizierung der MRD-Last sowie die frühzeitige Erkennung eines molekularen Rezidivs. Auch in Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie (CML) besitzt die molekulargenetische MRD-Diagnostik einen zentralen Stellenwert bei der Steuerung des Therapieerfolgs. So weisen mehr als 95% aller CML-Patienten bei Diagnose eine reziproke Chromosomentranslokation auf, die zu der Entstehung eines BCR-ABL1 Fusionsgens führt. Die Quantifizierung des hierbei gebildeten BCR-ABL1 Fusionstranskripts mittels sequenzspezifischer qPCR eignet sich für eine hochsensitive Bestimmung der MRD-Last. Ein Anstieg in der Mutationslast des BCR-ABL1 Fusionstranskripts bei CML-Patienten in kompletter molekularer Remission kann auf ein Therapieversagen hindeuten.
Weitere auf aktuellen Diagnoserichtlinien basierende (Schuurhuis et al., 2018, Döhner et al., 2017) und bei akuten Leukämien routinemäßig nachgewiesenen Mutationen zur MRD Diagnostik sind folgende:

  • akute Promyelozytenleukämie (APL) mit t(15;17)/PML-RARA
  • AML mit inv(16)/CBFB-MYH11
  • AML mit t(8;21)/RUNX1-RUNX1T1
  • AML mit t(9;11)/KMT2A-MLLT3
  • AML mit t(6;9)/DEK-NUP214
  • Philadelphia-positive ALL bzw. AML mit t(9;22)/BCR-ABL1
  • AML mit Mutationen im NPM1 Gen

Für eine vollständige Auflistung aller von uns angebotenen Marker verweisen wir sie auf den Zusatzbogen Molekulargenetik des Untersuchungsauftrags.

 

MRD mittels Immunphänotypisierung

Bei akuten Leukämien sind Leukämie-assoziierte aberrante Immunphänotypen (LAIPs) nachweisbar, die in dieser Konstellation auf den Zellen des normalen Knochenmarks nicht oder nur sehr selten vorkommen. Diese werden eingeteilt in:

 

  • „Cross-lineage“-Expression lymphatischer Marker bei der AML (z.B. CD19-positive AML) bzw. myeloischer Marker bei der ALL (z.B. CD33-positive ALL)
  • Asynchrone Antigenexpression (gleichzeitige Expression unreifer Marker mit reifen Markern, z.B. CD34- und CD11b-positive AML)
  • Fehlende Antigenexpression (z.B. HLA-DR-negative AML)
  • Antigenüberexpression (z.B. CD33++CD34++ AML)


Von zentraler Bedeutung für die korrekte Identifizierung eines LAIP und damit für die MRD-Quantifizierung ist die genaue Kenntnis des Immunphänotyps im normalen Knochenmark und der Vergleich mit demselben. Da in vielen Fällen die Expressionsstärke eines bestimmten Antigens den LAIP charakterisiert und diese sich zwischen verschiedenen Fällen sehr unterscheidet, ist es erforderlich, für jeden Patienten einen oder mehrere LAIPs individuell zu definieren. Um die MRD-Untersuchung zu ermöglichen, ist es somit unabdingbar, zum Zeitpunkt der Diagnosestellung den LAIP individuell zu erfassen. Für die Detektion eines LAIP ist insbesondere bei der AML die Verwendung eines umfangreichen Panels von Antikörpern notwendig, um auch seltene LAIPs identifizieren und für spätere Verlaufsuntersuchungen zur Verfügung zu stellen.

Kontakt

Dr. rer. nat. Manja Meggendorfer, MBA

MLL Münchner Leukämielabor GmbH
Max-Lebsche-Platz 31
81377 München

T: +49 (0)89 99017-355

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