CLL - chronische lymphatische Leukämie

Zytomorphologisch zeigt die B-CLL neben der Vermehrung reifer lymphatischer Zellen häufiger das Phänomen von „Gumprecht´schen Kernschatten“: Diese entsprechen CLL-Zellen, welche artifiziell auf dem Objektträger beim Ausstreichen zerplatzen. Sie kommen vor, beweisen aber nicht die Diagnose. Von der typischen B-CLL wird die B-Prolymphozytenleukämie (B-PLL) abgegrenzt, bei welcher ≥ 55% der Lymphozyten ein unreiferes Aussehen mit einem größeren Kern und einem deutlich sichtbaren Nukleolus zeigen. Bei der seltenen Transformation einer B-CLL in ein Richter-Syndrom finden sich blastäre Zellen.

Charakteristisch für die CLL ist eine Expression der B-Zellmarker CD19, CD20 und cyCD79a bei gleichzeitiger aberranter Expression des CD5-Antigens. Es besteht eine schwache Oberflächenexpression von CD22. Spezifisch für die CLL ist die schwache Expression von CD20 und die schwache bis fehlende Expression von FMC7 und CD79b. Charakteristischerweise beobachtet man auch eine schwache Expression der Oberflächenimmunglobuline mit einer klonalen Leichtkettenrestriktion. In der Regel wird CD23 exprimiert, was beim Mantelzelllymphom selten der Fall ist. Darüber hinaus weist das Mantelzelllymphom im Vergleich zur CLL eine stärkere Expression der Oberflächenimmunglobuline sowie neben einer höheren Expression von CD22 und FMC7 auch eine höhere Expression von CD79b auf. Dementsprechend ist die Diagnose einer CLL aus einem einzelnen Marker alleine nicht möglich. Vielmehr hat sich die Zusammenschau aller untersuchten Antigene und die Verwendung des daraus abgeleiteten Matutes-Score als sinnvoll erwiesen (Matutes et al. 1994, Moreau et al. 1997).

immunphänotyp. Charakteristika der B-CLL

• CD5+
• CD23+
• FMC7-
• slgM(+)
• sCD22(+) oder CD79b(+)

Von der CLL wird die monoklonale B-Zelllymphozytose vom CLL-Typ (MBL) abgegrenzt: Hier findet sich eine monoklonale B-Zell-Population < 5 x 10⁹/L im peripheren Blut; der Immunphänotyp entspricht dem einer CLL. Die Patienten sind zumeist asymptomatisch und weisen keine Neoplasie-typischen Laborveränderungen auf. Transformationen in eine B-CLL beobachtet man jährlich bei 1-2% aller Fälle.

Bei einer CLL/PL (CLL mit 10% bis 54% Prolymphozyten im peripheren Blut) zeigt der Immunphänotyp oftmals eine stärkere Expression von CD20 und Oberflächenimmunglobulinen (s-Ig) als bei der typischen CLL. Außerdem besteht eine schwächere Expression von CD23 sowie eine Positivität für CD22 und CD79b.

Bei der Prolymphozytenleukämie (B-PLL) (≥ 55% Prolymphozyten im peripheren Blut) zeigt sich keine oder nur eine schwache Koexpression von CD5, die Oberflächenexpression von Immunglobulinen und von CD20 ist stärker; ferner werden CD22 und FMC7 exprimiert.

Neben der Festlegung der Diagnose erlaubt die Immunphänotypisierung den Nachweis der messbaren Resterkrankung (MRD) bei der CLL. Der Phänotyp der CLL-Zellen - CD19+CD20+CD79-CD5+ - unterscheidet diese deutlich von normalen B-Lymphozyten. Der MRD-Level bei der CLL sind den Ergebnissen mehrerer größerer Studien zufolge von prognostischer Relevanz. Ein niedriges MRD-Level während und nach Therapie ist mit einem längeren progressionsfreien Überleben (PFS) und einem verlängerten Gesamtüberleben (OS) assoziiert. Patienten mit negativem MRD-Level zeigten ein längeres PFS als Patienten mit positiven MRD-Level und das unabhängig ob sie in kompletter oder partieller Remission sind. Somit ermöglicht eine MRD-Quantifizierung eine verbesserte PFS-Vorhersage sowohl bei Patienten, die eine partielle Remission als auch eine komplette Remission erreichen (Kovacs et al. 2016, Böttcher et al. 2012).

Die Chromosomenanalyse hatte für die CLL früher nur eine untergeordnete Rolle gespielt, da die notwendige Kultivierung der CLL-Zellen in vitro kaum gelang. Seit eine Kultivierung der CLL-Zellen jedoch zuverlässig möglich ist, lassen sich damit mehr Aberrationen als mit der FISH-Analyse nachweisen (Dicker et al. 2006).

Auch zur Abgrenzung zu anderen reifzelligen B-Zell-Neoplasien kann die Chromosomenanalyse bei der B-CLL hilfreich sein. Es zeigte sich, dass Patienten bei unauffälligem Befund in der FISH-Analyse aber einem aberranten Karyotyp in der  Chromosomenanalyse ein verkürztes Intervall bis zum Therapie-Bedarf und ein kürzeres Überleben aufwiesen, als Patienten, die auch in der Chromosomenanalyse einen normalen Karyotyp zeigten (Rigolin et al. 2012)

Die Ergebnisse der Chromosomenbänderungsanalysen zeigten, dass das Spektrum zytogenetischer Veränderungen bei CLL größer ist, als dies durch die FISH-Methodik ersichtlich war. Typisch für die CLL sind genomisch unbalancierte Ereignisse (Haferlach C et al. 2007). Die häufigsten Veränderungen sind die 13q-Deletion, 11q-Deletion, Trisomie 12, 6q-Deletion und 17p-Deletion. Eher seltene Veränderungen stellen die Trisomie 3 bzw. 3q-Zugewinne, Zugewinne von 2p, 8q und 11q sowie Translokationen unter Involvierung der Immunglobulin-Loci (2p12 (Ig kappa), 14q32 (IgH), 22q11 (Ig lambda)) dar (Döhner et al. 1999, Stilgenbauer et al. 2002). Die Translokationen t(11;14)(q13;q32), t(14;18)(q32;q21) und t(14;19)(q32;q13) werden ebenfalls selten beobachtet.

Ungefähr 20% der CLL-Patienten zeigen in der Chromosomenbandenanalyse einen komplex aberranten Karyotyp (≥ 3 Aberrationen) (Haferlach C et al. 2007; Haferlach C et al. 2010). Herling et al. 2016 zeigten, dass ein komplex aberranter Karyotyp ein unabhängiger prognostischer Faktor ist, der sogar den prognostischen Effekt von TP53-Alterationen übertreffen kann. Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass ein komplex aberranter Karyotyp erst ab ≥ 5 Aberrationen ein unabhängiger ungünstiger Faktor ist. Wobei ein komplex aberranter Karyotyp mit 3 oder 4 Aberrationen nur mit einer ungünstigen Prognose assoziiert ist, wenn zusätzliche eine TP53-Deletion und/oder eine TP53-Mutation vorliegen. Komplex aberrante Karyotypen mit einer +12 und +19 haben eine günstige Prognose (Baliakas et al. 2019). Somit zeigt sich, dass eine detaillierte Analyse für eine bestmögliche prognostische Einordnung erforderlich ist.

Die Chromosomenbandenanalyse ist noch nicht fest in der Diagnostik  bei der CLL etabliert, könnte aber aufgrund der neuen prognostischen Erkenntnisse beim komplex aberranten Karyotyp in Zukunft eine bedeutende Rolle spielen. Die Chromosomenbandenanalyse wurde bereits in den Empfehlungen des iwCLL (Hallek et al. 2018), den NCCN Guidelines (Stand 2019) und der S3-CLL Leitlinie aufgenommen. Über eine Unterstützung bei der prognostischen Einordnung hinaus, kann die Chromosomenbandenanalyse helfen, um die CLL von anderen indolenten Lymphom abzugrenzen.

Mit der FISH-Analyse und einem Standard-Panel an FISH-Sonden können bei ca. 80% der CLL-Patienten genetische Veränderungen nachgewiesen werden. Zu den häufigsten chromosomalen Aberrationen zählen die 13q-Deletion, gefolgt von der Trisomie 12 und 11q-Deletion (Döhner et al. 2000, Hallek et al. 2008). Weniger häufig werden die 6q-Deletion und die 17p-Deletion beobachtet. Die FISH Analyse ist wichtig für die prognostische Einschätzung sowohl unter Standardtherapie als auch moderneren Therapien. Nach der Onkopedia Leitlinie CLL soll eine FISH-Untersuchung zum Nachweis einer del(17p13) und weitere genetische Untersuchungen bei atypischem Phänotyp zur Abgrenzung gegenüber anderen indolenten Lymphomen durchgeführt werden. Nach der S3 Leitlinie CLL sollte zusätzlich noch eine Untersuchung auf 11q-Deletion erfolgen. Patienten mit einer del(11)(q22.3) können von einer Chemmoimmuntherapie profitieren. Der internationale CLL Workshop (iwCLL) empfiehlt neben der Untersuchung auf das Vorliegen einer del(11q) bzw. del(17p) weitere FISH Untersuchung auf das Vorliegen einer del(13q) und 12q Zugewinnen im peripheren Blut (Onkopedia Leitlinie CLL: Stand 04/2019, S3 Leitlinie 2018, Hallek et al. 2018).

Weiterhin ist die Untersuchung auf eine t(11;14)/IGH-CCND1 zur Abgrenzung zwischen CLL und Mantelzelllymphom sinnvoll. Allerdings können auch einige wenige eindeutige CLL - mit allen klassischen Kriterien charakterisiert - eine t(11;14) aufweisen.

Beim IGHV-Status werden die somatische Mutationen in der variablen Region (V) der schweren Kette (H) der Immunglobuline (IG) bestimmt. Etwa 60% aller CLL-Patienten weisen einen mutierten IGHV-Status auf. Dabei wird die Last der somatischen Hypermutationen in einem spezifischen Teil des B-Zellrezeptors - dem sogenannten IGHV (immunoglobulin heavy chain variable)-Gen - im Vergleich zur ursprünglichen DNA-Sequenz bestimmt. Ein Vorhandensein von 2% oder weniger Mutationen wird als „unmutiert“ und ein Vorhandensein von mehr als 2% Mutationen als „mutiert“ bezeichnet. Neuer Einteilungen für den IGHV Mutationsstatus sind: Unmutierter Status ≤2% Mutationen, grenzwertiger Status: 2,1-3% Mutationen und mutierter Status >3% Mutationen. Wobei eine prognostische Aussage über den grenzwertigen IGHV-Mutationsstatus noch nicht möglich ist (Davis et al. 2016). Da sich das Ergebnis der IGHV-Mutationsanalyse für eine spezifische CLL-Population im Verlauf nicht verändert, ist eine mehrmalige Analyse im Regelfall nicht notwendig. Bei ca. 30% der CLL wurden ähnliche Muster im B-Zellrezeptor entdeckt, eine sogenannte Stereotypie (Messmer et al. 2004, Tobin et al. 2004). Stereotypie bedeutet Ähnlichkeit der Aminosäure-Sequenz in der CDR3-Region. Unterschiedliche stereotype Rearrangement haben unterschiedliche prognostische Bedeutungen (Stamatopoulos et al. 2017). Die unterschiedlichen Subgruppen der stereotypen B-Zellrezeptoren werden „subset“ genannt. Subsets kommen häufiger bei CLL mit unmutiertem IGHV Status (U-CLL) als bei CLL mit mutiertem IGHV-Status (M-CLL) vor (40% vs. 10%). Unterschiedliche „subsets“ sind mit unterschiedlichen Prognosen des Krankheitsverlaufs assoziiert.

Der IGHV Mutationsstatus hat rein prognostische Bedeutung und kann bei Initialdiagnose laut S3 Leitlinien CLL erhoben werden, sollte aber spätestens bei Therapieindikation durchgeführt werden. Der Internationalen CLL Workshop (iwCLL) empfiehlt ebenfalls eine einmalige Untersuchung des IGHV Mutationsstatus vor Therapiebeginn (Hallek et al. 2018). Bei einem unmutierten IGHV-Status sollte laut den Onkopedia Leitlinie CLL eine Therapie mit Ibrutinib erfolgen.

Mutationen in TP53, SF3B1, NOTCH1, ATM und BIRC3

TP53-Gen

Bei TP53-Veränderungen muss zwischen Mutationen und Deletionen (17p-) unterschieden werden. TP53-Mutationen sind Veränderung der Basenabfolge innerhalb des Gens und können nur mittels Sequenzierung nachgewiesen werden. Bei einer TP53-Deletion kommt es zum Verlust von genetischem Material des kurzen Armes von Chromosom 17 (17p), welcher das gesamte Gen überspannt und mittels FISH, bei entsprechender Größe auch mittels Chromosomenanalyse, nachgewiesen werden kann. Bei Erstdiagnose beträgt die Inzidenz von TP53-Mutationen ca. 8%. TP53-Deletionen treten bei etwa 4% auf, zumeist in Kombination mit einer TP53-Mutation aber jeweils auch allein (Zenz et al. 2010). Um den TP53-Status eines Patienten umfassend zu klären, muss somit sowohl eine FISH-Analyse für 17p- als auch eine TP53 Mutationsanalyse durchgeführt werden. Laut iwCLL Guidelines (Hallek et al. 2018) sollten TP53-Aberrationen vor Therapie untersucht werden und bei jedem Therapiewechsel sollte die Untersuchung wiederholt werden. Laut S3-Leitlinien zur CLL sollte die letzte Bestimmung von TP53-Veränderungen maximal 12 Wochen vor Therapiebeginn erfolgt und sonst erneut durchgeführt werden, da TP53-Veränderungen auch erst im Verlauf der CLL auftreten können (S3-Leitlinie CLL 2018). In fortgeschrittenen Stadien und bei refraktärer CLL steigt die Häufigkeit der TP53-Veränderungen deutlich an (siehe Tabelle 1).

SF3B1-Gen

SF3B1-Mutationen kommen bei ca. 6% der CLL-Patienten vor. Die Inzidenz ist bei refraktären CLL Patienten deutlich erhöht (Tabelle 1). SF3B1-Mutationen korrelieren mit einem unmutierten IGHV-Status, ATM-Veränderungen und einem stereotypen IGHV3-21-Rearrangement (Subset #2). Es gibt vermehrt Hinweise darauf, dass diese Mutationen mit einer intermediären Prognose assoziiert sind (Oscier et al. 2013, Stilgenbauer et al. 2014, Jeromin et al. 2014).

NOTCH1-Gen

NOTCH1-Mutationen kommen gehäuft bei CLL mit einem unmutierten IGHV-Status vor und in Zusammenhang mit Trisomie 12. NOTCH1-Mutationen werden bei etwa 10% der CLL-Erstdiagnosen beobachtet und sind mit einem etwa 20-fach erhöhten Risiko für eine Transformation in ein DLBCL assoziiert. Es gibt Hinweise darauf, dass Patienten mit NOTCH1-Mutationen eine intermediäre Prognose aufweisen und keinen Nutzen von der Zugabe von Rituximab zur Chemotherapie mit Fludarabin/Cyclophosphamid erfahren (Stilgenbauer et al. 2014). Allerdings muss dies noch in weiteren unabhängigen Studien bestätigt werden.

ATM-Gen

ATM-Veränderungen können sowohl durch Mutationen als auch Deletionen (11q-) verursacht werden. Mutationen treten bei ca. 6% der CLL-Patienten bei Diagnose auf. Deletionen von 11q22 beinhalten immer das ATM-Gen. In etwa 30% der Fälle mit einer 11q-Deletion findet sich auch eine ATM-Mutation. Diese Patienten zeigen eine intermediäre Prognose, wobei es Hinweise darauf gibt, dass beim gleichzeitigen Auftreten einer Deletion und einer Mutation eine ungünstigere Prognose zu erwarten ist als mit nur einer ATM-Veränderung (Austen et al. 2007, Skowronska et al. 2012). Das eingeschränkte Ansprechen auf Chemotherapie bei Patienten mit ATM Veränderung scheint durch die Zugabe von Rituximab verbessert werden zu können (Stilgenbauer et al. 2014). Da das Gen sehr groß und daher aufwendig zu sequenzieren ist, empfiehlt sich eine Analyse nur bei speziellen Fragestellungen.

BIRC3-Veränderungen können in BIRC3-Mutationen und BIRC3-Deletionen unterteilt werden. Die Inzidenz von BIRC3-Veränderungen bei Erstdiagnose liegt bei 4%, bei refraktären Patienten ist sie jedoch höher. Das Gen BIRC3 liegt auf dem langen Arm von Chromosom 11 in der Nähe des ATM-Gens. Bei 80% der CLL-Patienten mit einer ATM-Deletion ist BIRC3 ebenfalls deletiert. Für Patienten mit BIRC3-Veränderungen wird eine ungünstige Prognose angenommen (Rossi et al. 2013).