Akute myeloische Leukämie (AML) – Molekulargenetik
Nachweis von Fusionsgenen
Eine grosse Rolle in der molekularen Diagnostik der AML spielt der Nachweis von Fusionsgenen mittels RT-PCR (reverse Transkriptions-PCR). Bei ca. 25% aller AML liegen reziproke Chromosomenrearrangements vor. Die molekularen Korrelate bzw. Fusionsgene der meisten reziproken zytogenetisch detektierbaren Rearrangements sind bekannt. Bei der AML führen die häufigsten reziproken Translokationen t(15;17), t(8;21), und inv(16)/t(16;16) auf molekularer Ebene zur Bildung der PML-RARA, RUNX1-RUNX1T1 (=AML1-ETO) sowie CBFB-MYH11-Fusionsgene. Rearrangements des MLL-Gens finden sich bei ca. 5% aller AML, wobei mehr als 50 verschiedene Translokationspartner beschrieben wurden. Darüber hinaus lassen sich zahlreiche weitere seltene Rearrangements nachweisen, welche zwar oftmals <1% aller Fälle betreffen, jedoch im Einzelfall nützliche Zielstrukturen für die Diagnostik darstellen.
Anhand der RT-PCR lassen sich u.a. folgende Fusionsgene nachweisen: RUNX1-RUNX1T1 (AML1-ETO), CBFB-MYH11, PML-RARA, MLL-Fusionen, CALM-AF10, CHIC2-ETV6, NUP98-HOX9, DEK-NUP214, MYST3-CREBBP.
Translokationen mit den dazugehörigen Fusionsgenen bei der AML
Translokationen mit den dazugehörigen Fusionsgenen bei der AML
| Zytogenetik | Fusionsgen | FAB-Subtyp | Häufigkeit | |
| Kinder | Erwachsene | |||
| t(8;21)(q22;q22) | RUNX1-RUNX1T1 (AML1-ETO) | M2/(M1) | 10-15% | 8-12% |
| inv(16)(p13q22) | CBFB-MYH11 | M4eo | 6-12% | 8-12% |
| t(15;17(q22;q21) | PML-RARA | M3/M3v | 8-15% | 8-10% |
| t(6;11)(q27;q23) | MLL-MLLT4 (MLL-AF6) | M4/M5a | 2-5% | <1% |
| t(9;11)(p22;q23) | MLL-MLLT3 (MLL-AF9) | M5a | 8-10% | 1-2% |
| t(10;11(p13;q23) | MLL-MLLT10 (MLL-F10) | M5a | <1% | 1-2% |
| t(11;19)(q23;p13) | MLL-MLLT1 (MLL-ENL) | M5a | <1% | <1% |
| MLL-ELL | M5a | <1% | <1% | |
| t(3;21)(q26;q22) | RUNX1-EVI1 | - | 1% | <1% |
| t(6;9)(p23;q34) | DEK-NUP214 | M1/M2/M4 | 1-2% | <1% |
| t(8;16)(p11;p13) | MYST3-CREBBP | M4/M5 | <1% | <1% |
| t(1;22)(p13;q13) | OTT-MAL | M7 | 2% | - |
| t(7;11)(p15;p15) | HOXA9-NUP98 | M2 | - | <1% |
| t(10;11)(p13;q14) | CALM-AF10 | M0/M1/M5 | - | <1% |
| t(16;21)(p11;q22) | FUS-ERG | - | - | <1% |
Für die Fusionsgene PML-RARA, RUNX1-RUNX1T1 (=AML-ETO) und CBFB-MYH11 wurde nachgewiesen, dass eine Quantifizierung der Expression bereits zum Zeitpunkt der Diagnosestellung von prognostischer Relevanz ist. Auch für alle anderen Fusionsgene ist eine Quantifizierung zum Diagnosezeitpunkt sinnvoll, da dieser Messwert als Ausgangswert für künftige Verlaufskontrollen dient.
Nachweis weiterer molekularer Mutationen
In den letzten Jahren wurden zahlreiche Mutationen und Rearrangements von Genen beschrieben, die zytogenetisch nicht erkennbar sind, aber einen wichtigen Beitrag in der molekularen Diagnostik und Prognoseeinschätzung der AML spielen.
Am häufigsten sind Mutationen im Nucleophosmin (NPM1)-Gen. Diese finden sich bei ca. 35% aller AML-Fälle und sogar 55% bei AML mit normalem Karyotyp. Die Prognose ist günstig, wenn nicht zusätzlich eine FLT3-LM vorliegt.
Auch bei Längenmutationen im FLT3-Gen (FLT3-LM) besteht eine Assoziation zum normalen Karyotyp. Die Prognose ist ungünstig, besonders wenn zusätzlich das normale Allel (bzw. Wildtypallel) verloren geht; deshalb ist bei dieser Mutation zusätzlich die Angabe der „Mutationslast“ wichtig: Diese kann als Ratio von FLT3-LM und FLT3-Wildtyp angegeben werden. Die FLT3-LM finden sich bei 10-15% aller kindlichen und bei 20-25% aller AML-Fälle im Erwachsenenalter. Ausserdem haben weitere 6-7% aller AML Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäme des FLT3-Gens (TKD-Mutationen), welche prognostisch aber offensichtlich nicht so ungünstig sind wie die FLT3-LM.
Relevant sind ferner partielle Tandemduplikationen im MLL-Gen (MLL-PTD), welche prognostisch auch ungünstig zu bewerten ist.
Mutationen im Transkriptionsfaktor CEBPA wurden bei 7-15 % der AML mit normalem Karyotyp beschrieben und sind prognostisch günstig, wenn beide Allele mutiert sind. Auch hier wirkt sich eine zusätzliche FLT3-LM ungünstig aus. Ein weiterer Transkriptionsfaktor RUNX1 (=AML1) ist bei 15-30% der AML-Fälle mutiert und mit einer ungünstigen Prognose assoziiert. In der WHO-Klassifikation von 2008 erhielten sowohl die NPM1- als auch die CEBPA-Mutation den vorläufigen Status einer eigenständigen Entität.
Einige Punktmutationen z.B. in den KIT- oder RAS-Genen sind zwar nicht spezifisch für die AML, tragen aber zusammen mit RUNX1-RUNX1T1 (=AML1-ETO) bzw. CBFB-MYH11 entscheidend zur Leukämieentstehung bei. So geht man heute von einer Mehrschritt-Hypothese bei der Leukämieentstehung aus. Mutationen in Tyrosinkinasegenen wie ABL1, FLT3 und KIT sowie den RAS-Protoonkogenen werden als Typ-I-Mutationen bezeichnet und steigern die Proliferation hämatopoetischer Zellen. Fusionsgene und Mutationen in Transkriptionsfaktoren werden hingegen als Typ-II-Mutationen bezeichnet und führen zu einem Differenzierungsstopp. Weitere Mutationen in Genen mit einer wichtigen Funktion für Zellzyklus, Apoptose und DNA-Reparatur und erst das Zusammenspiel mehrerer Mutationstypen führt zu dem Vollbild einer akuten Leukämie.
Das Spektrum der molekularen Marker erweitert sich bei der AML zunehmend. Dies wird beispielsweise durch die Einführung neuer Sequenzierungstechniken („next generation sequencing“, NGS) erleichtert. Mutationen im TET2-Gen (“TET oncogene family member 2”) auf dem Chromosom 4q24 wurden bei 15-25% aller AML-Fälle detektiert. Sie sind auch bei zahlreichen anderen myeloischen Entitäten wie MDS nachweisbar. Ob ein Einfluss auf die Prognose besteht, ist Gegenstand aktueller Studien. Mutationen der Isocitrat-Dehydrogenase-1 (IDH1) und IDH2-Gene wurden bei bis zu 20% aller AML-Patienten festgestellt. Bei NPM1-negativer AML und NPM1-mutierter/FLT3-unmutierter AML wurde ein ungünstiger Einfluss beschrieben. Darüber hinaus wurden bei ca. 10% aller Patienten mit de-novo-AML Mutationen im ASXL1 (additional sex-comb like 1)-Gen, welches auf dem Chromosomenabschnitt 20q11 lokalisiert ist, identifiziert. Erste Arbeiten deuteten einen ungünstigen prognostischen Einfluss an, was jedoch weiterer Untersuchungen bedarf. Sehr selten sind Mutationen im “Casitas B-cell lymphoma” (CBL)-Gen auf Chromosom 11q23 (<2% aller AML-Fälle).
Zum Nachweis dieser molekularen Mutationen stehen eine Vielzahl von Nachweis-Techniken zur Verfügung. Beispielhaft erwähnt seien hier die konventionelle reverse Transkriptions- (RT)-PCR (FLT3-LM, Fusionsgene), die „Gene-Scan“-Analytik (FLT3-LM, NPM1), Schmelzkurvenanalyse (FLT3-TKD, NPM1, RAS, KITD816), DHPLC/WAVE (RUNX1 bzw. AML1, CEBPA), sowie Real-time PCR (MLL-PTD, Fusionsgene, EVI1-Expression). Bei Nachweis einer Mutation anhand dieser Techniken bietet sich dann die Sequenzierung zur genauen Charakterisierung an. Diese molekularen Marker eröffnen im Folgenden neue Zielstrukturen für die PCR-basierte Detektion minimaler Resterkrankung (=“minimal residual disease“; MRD).
Molekulare Mutationen bei AML
| Mutation | Häufigste Subtypen | Häufigkeit gesamt | Prognose |
| NPM1 | Normaler Karyotyp (55%) | 30% | günstig |
| FLT3-LM | Normaler Karyotyp (40%) t(15;17) (35%) |
20-25% | ungünstig |
| FLT3-TKD | alle AML | 6-7% | je nach zusätzl. Alterationen |
| MLL-PTD | Normaler Karyotyp (11%) Trisomie 11 (20-50%) |
6,5% | ungünstig |
| CEBPA | Normaler Karyotyp (7%) | 4% | günstig |
| KITD816 | t(8;21) (12%) | 1,5% | ungünstig |
| KITexon8 | inv(16) (10%) | <1% | ungünstig |
| NRAS | inv(16) (45%) inv(3)/t(3;3) (40%) |
10% | neutral |
| KRAS | inv(16); t(8;21) (5-20%) (bei Kindern) |
<1% | prognost. Bedeutung unklar |
| RUNX1 (AML1) | AML FAB M0 (22%) Trisomie 21 (30%) |
15% | ungünstig |
| IDH1/2 | Normaler Karyotyp (30%) | 15-20% | ungünstig |
| TET2 | - | 15-25% | noch nicht definiert |
| CBL | inv(16), t(8;21) | <2% | noch nicht definiert |